溃疡性结肠炎（UC）是一种由基因、免疫、心理、环境等多因素参与引起的肠道疾病，临床以黏液脓血便、腹痛、里急后重为主［1］。目前多数观点认为由机械、化学、生物和免疫屏障组成的肠屏障遭到破坏在UC发病中起到了重要的作用［2］。5-氨基水杨酸制剂为轻中度UC的主要治疗药物，但在使用中发现其诱导缓解效率较低、患者依从性差，更无法缓解患者腹部怕凉、手足不温、体质量下降等症状。中医药辨证论治用药灵活，在减轻UC病情、预防复发方面具有较明显的优势［3］，而这可能与复方多靶点调控相关机制有关。紧密连接是保证机械屏障正常功能的基本结构，Occludin蛋白作为其中的重要组成部分，在维系上皮细胞极性、维持紧密连接完整结构方面起关键作用［4］。目前尚未见到从温中健脾、清热燥湿角度探讨扶正祛邪法通过改善Occludin蛋白表达发挥疗效的相关报道。因此本研究拟从温中健脾、清热燥湿角度立法，研究代表方清肠温中方对寒热错杂证UC大鼠及Occludin蛋白的作用影响，为温中健脾、清热燥湿法治疗溃疡性结肠炎（寒热错杂证）临床应用提供科学依据，为溃疡性结肠炎的中医药治疗提供新的治疗思路。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠70只，体质量（200±20）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0002，饲养于北京中医药大学SPF级动物房，12 h/12 h光照/黑暗循环，温度（22±2）℃，湿度50%～60%，自由饮食饮水。

1.2 药物与试剂 清肠温中浸膏方 （黄连6 g，炮姜10 g，三七6 g，木香6 g，炙甘草6 g等）由北京中医药大学中药学院提供。阳性对照中药乌梅丸（乌梅16 g，细辛 6 g，干姜 10 g，黄柏 6 g，桂枝 6 g，黄连 16 g，当归 4 g，附子 6 g，川椒 4 g，人参 6 g），购自北京中医药大学东方医院颗粒剂药房。阳性对照西药美沙拉秦缓释颗粒（艾迪莎，国药准字H），购自北京中医药大学东方医院药房；5%TNBS（w/v）（P2297）购自美国Sigma公司。4%多聚甲醛、无水乙醇购自中农博信（北京）科技有限公司；Anti-Occludin（ab）抗体购自美国Abcam公司。

1.3 分组与造模 SD大鼠适应性饲养1周，采用随机数字表法将70只大鼠随机分为空白组、模型组、清肠温中方高剂量组（2.0 g浸膏/kg）、清肠温中方中剂量组（1.0 g 浸膏/kg）、清肠温中方低剂量组（0.5 g 浸膏/kg）、美沙拉秦组（400 mg/kg）和乌梅丸组（8.4 g生药/kg）共7 组，每组 10 只。 采用 2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）/无水乙醇改良复合法复制UC模型［5］。除空白组外，所有大鼠禁食不禁水12 h，10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射以麻醉大鼠，将石蜡油浸润婴儿10 cm圆头灌肠管，由肛门缓慢插入8 cm，将终浓度33.3%无水乙醇的 TNBS（100 mg/kg）溶液0.6mL一次性于 1 min内缓慢推注入内，每只大鼠使用新灌肠管。保持仰卧位15 min后，放回笼内棉花保暖至清醒，共3 d，每日1次。

1.4 给药方法 实验第4日起，除空白组外，所有大鼠连续10 d以相应药物灌胃干预（1 mL/100 g），清肠温中浸膏方高、中、低剂量组分别以2.0 g浸膏/kg（临床患者2倍用量）、1.0 g浸膏/kg（临床患者用量）、0.5 g浸膏/kg（临床患者0.5倍用量）；美沙拉秦组以400 mg/kg（临床患者用量）；模型组以蒸馏水灌胃。

1.5 标本采集与检测 实验期间每日记录大鼠体质量，观察一般情况和便质，化验便潜血。实验第14日以10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，在装有碎冰的培养皿中迅速进行全结肠截取，将骨盆剪开彻底暴露盆腔，从肛门到膨大的回盲部全部取出，于PBS缓冲液中迅速涮洗并纵向剖开，根据CDMI评分标准进行评分。分离远端结肠（距肛门10 cm）2 cm，于4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，片厚4 μm，抗原修复后采用DAB显色法免疫组化染色观察Occludin蛋白表达。采用Image J软件（1.37c NIH，USA）对染色结果进行分析计算，平均光密度值（AOD＝IntDen/Area）表示目标蛋白的具体染色情况。

1.6 观察指标 1）疾病活动指数（DAI）［6］。 体质量下降率：无下降0分；1%～5%记1分；5%～10%记2分；10%～15%记3分；大于15%记4分。便质：正常0分，稀软便2分；水样便4分；便潜血：阴性0分；阳性2分；肉眼血便 4 分。 2）结肠黏膜损伤指数（CMDI）［3］。 0分为无损伤；1分为无溃疡；2分为肠壁变厚，无溃疡；3分为有溃疡，直径＜1 cm；4分为有溃疡，直径＞1 cm，肠管与周围组织无粘连；5分为有溃疡，直径＞1 cm，肠管与周围组织有粘连。3）结肠组织病理学评分［4］。炎细胞浸润：0分为无浸润；1分为轻度；2分为中度；3分为重度。肉芽肿：0分为无；1分为轻度；2分为中度；3分为重度。病变深度：0分为黏膜层；1分为黏膜下层；2分为肌层；3分浆膜层。

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